《超級馬裏奧64》遊戲講述的是：馬裏奧收到了壹封來自碧奇公主的信，信中碧奇公主邀請他到城堡裏，於是，馬裏奧大叔滿心歡喜的出發了。沒想到的是，到了城堡之後卻看不到壹個人影。“這肯定又是庫巴搞的鬼！”原來，庫巴奪走了守護城堡的“能源之星”，並將碧奇公主和城堡的居民們封印在了畫中……
太陽從東面升了起來，蘑菇城堡新的的壹天又來了，碧奇公主從睡夢中醒來，公主壹邊梳洗打扮壹邊計劃著新的壹天，今天幹什麽呢？老是和蘑菇們做那些遊戲實在太沒勁了，對了！做壹個蛋糕吧——個漂亮可口的大蛋糕，再請馬裏奧到城堡來壹塊品嘗。好，就這麽辦！於是，城堡中又忙碌開了，與此同時，世界的另壹邊，庫巴也在它的老巢裏想著鬼主意…… 馬裏奧接到請柬，興沖沖地奔向城堡，但奇怪的是，他敲門卻沒人應，馬裏奧發現門沒有鎖上就推門進了城堡，城堡裏面空蕩蕩的，公主和蘑菇們不知道什麽地方去了，突然，馬裏奧聽到壹陣陰森的笑聲，壹種不祥的預感湧上他的心頭。好不容易在壹個角落裏找到了壹個蘑菇，蘑菇告訴馬裏奧，BOWSER——果然又是他綁架了公主，偷走了城堡的能源之星並用能源之星的力量創造了強大的軍隊！而蘑菇們也被軟禁了起來。 真是太糟了，看來找回能源之星，救出公主就靠馬裏奧了…… 馬裏奧：MARIO，男主角 碧奇公主：PEACH TOADSTOOL，女主角，被BOWSER藏起來了。 王國居民：TOAD MUSHROOM，可以告訴妳很多事，幫上大忙。有的還會給妳能源之星。 快樂雲：FISHING LAKITU，給妳攝影，在妳背後跟蹤，可以調整視角。 庫巴鮑澤：BOWSER，關底BOSS，綠殼，邪惡的大烏龜龍，馬裏奧的宿敵。 疾風龜：KOOPA THE QUICK，同他賽跑，比贏了可以得到星星。 紅炸彈兵：PEACE-LOVING BOB-OMB，友好的炸彈，遊戲中，馬裏奧必須先找到他，讓他打開大炮的開關，然後才能使用大炮。
綠耀西:YOSHI，“很好”？隱藏人物，可愛的綠色小恐龍。